AMT Halo : Maintien des performances des colonnes LC

Introduction

Pour maximiser la durée de vie d’une colonne HPLC et garantir ses meilleures performances, il est nécessaire de l’entretenir correctement. De nombreux facteurs différents peuvent contribuer à une perte de résolution ou de sensibilité, mais les facteurs suivants sont souvent à l’origine de la grande majorité des problèmes de performances des colonnes.

Contamination

Souvent, l’échantillon peut contenir des composés, provenant de la matrice de l’échantillon, qui peuvent être retenus par la phase stationnaire. Les sels, les lipides, les plastifiants et les polymères sont quelques-unes des substances qui peuvent entrer en contact avec la phase stationnaire pendant l’analyse. Ces substances peuvent alors avoir des effets délétères sur la colonne, le détecteur, et provoquer des pics transitoires pendant l’analyse. Si ces substances ne sont pas éluées par la phase mobile, elles peuvent s’accumuler sur la colonne. Au fil du temps, les analytes peuvent interagir avec ces impuretés et affecter le mécanisme de séparation, ce qui entraîne des décalages du temps de rétention et des trainées de pics. En outre, ces impuretés qui s’accumulent peuvent créer un blocage, entraînant une augmentation de la contre-pression de la colonne, endommageant la pompe, et pouvant conduire à la formation d’un vide dans le lit de la colonne. L’utilisation d’une colonne de garde est fortement recommandée pour éviter ce type de problèmes. Les colonnes de garde sont de courtes colonnes remplies de phase stationnaire similaire à celle de la colonne analytique, qui sont installées en amont de la colonne analytique. Après une période d’utilisation donnée, elles sont jetées et une nouvelle colonne de garde est installée afin de maximiser la durée de vie de la colonne analytique.

Instabilité du pH

Assurez-vous toujours que l’analyse est effectuée dans la plage de pH de la colonne. Pour cela, vous pouvez consulter les informations produits données par le fabricant AMT à partir de notre catalogue Chromatographie (parties E, F et G) ou des fiches produits disponibles sur notre site afin de confirmer que le pH de phase mobile est compatible avec la phase stationnaire utilisée.
Lorsqu’elle n’est pas utilisée, la colonne doit être rincée afin de ne pas la conserver avec des tampons / modifiants acides ou basiques.

Pression d’utilisation élevée

Les phases stationnaires à base de particules superficiellement poreuses (SPP) permettent des séparations très résolutives (car les colonnes sont très efficaces) par rapport aux particules totalement poreuses (FPP) de plus petites tailles. La pression d’utilisation est plus faible pour une performance chromatographique donnée qu’avec des particules totalement poreuses (FPP) de plus petites tailles. Une bonne pratique de laboratoire consiste à concevoir les méthodes d’analyses pour qu’elles fonctionnent aux pressions de fonctionnement les plus basses possibles afin de maximiser la durée de vie des instruments et des colonnes. Il est également important d’éviter les à-coups de pression sur la colonne. Les à-coups de pression sont des augmentations ou des diminutions soudaines de la pression dans un court laps de temps. Ils peuvent entraîner la formation d’un vide dans le lit de la colonne et contribuer à l’élargissement puis au dédoublement des pics sur le chromatogramme correspondant.
Tous les colonnes remplies avec des particules de 2 μm, et les colonnes remplies avec du 2,7 μm de 1000 Å dont des diamètres internes de 2.1 mm et 3.0 mm supportent des pressions jusqu’à 1000 bars. Toutes les autres dimensions de colonnes et tailles de particules supportent des pressions jusqu’à 600 bars.

Colonnes Capillaires

Taille de particules	Diamètre interne (mm)	Pression (bar)
Toutes	0.75 & 0.1	600
Toutes	0.2 – 0.5	400

Colonnes non capillaires

Taille de particules	Diamètre interne (mm)	Pression (bar)
Toutes	1.0	600
2 μm	2.1 ; 3.0	1000
2.7 μm 1000 Å (taille des pores)	2.1 ; 3.0	1000
2.7 μm	2.1 ; 3.0 ; 4.6	600
3.4 μm 400 Å (taille des pores)	2.1 ; 3.0 ; 4.6	600
5.0 μm	2.1 ; 3.0 ; 4.6	600

NB : La mention “Tout” indique toutes les tailles de particules disponibles.

Mauvaise qualité de la phase mobile

Il est essentiel d’utiliser des solvants de la plus haute qualité disponible (qualité HPLC ou MS) pour la phase mobile, et de maintenir le pH de la phase mobile dans la plage de pH compatible pour la colonne utilisée. Pour cela, vous pouvez consulter les informations produits données par le fabricant AMT à partir de notre catalogue Chromatographie (parties E, F et G) ou de fiches produit disponibles sur notre site. Les solvants de mauvaise qualité contiennent souvent des impuretés qui peuvent s’absorber sur la colonne et interférer avec la séparation.
Il est recommandé de filtrer la phase mobile avant de l’utiliser, si non, l’utilisation d’une colonne de garde pendant l’analyse permettra de s’assurer que la phase mobile entrant dans la colonne sera exempte de particules solides.

Température excessive

Pour une durée de vie maximale de la colonne, il est essentiel de ne pas dépasser la température maximale de fonctionnement de la colonne. Pour cela, vous pouvez consulter les informations produits données par le fabricant AMT à partir de notre catalogue Chromatographie (parties E, F et G) ou de fiches produit disponibles sur notre site.

Temps d’équilibrage insuffisant

Le temps d’équilibrage d’une colonne dépend de ses dimensions. En général, une colonne est équilibrée après un rinçage de 20 volumes de colonne (avec tampons salins ou en mode Hilic ou Phase normal). En phase inverse, avec des phases mobiles dont le pH régulé avec des additifs organiques comme l’acide formique ou acétique, 10 volumes de colonnes sont généralement utilisés.
Pour calculer le volume de la colonne, utilisez l’équation suivante.

Voici un exemple de calcul

1. Volume mort (μL) = 0.25 x π x (Diamètre2) x Longueur x Volume des Pores
2. π = 3.14
3. Volume Pore = 0.50 pour les particules partiellement poreuses (% de vide dans la colonne comprenant le volume intra et inter perticulaire)
4. Diamètre & Longueur doivent être en mm

Exemple pour une colonne de dimension 100 mm x 2.1 mm :
(2.1 mm)²= 4.41mm
0.25 x 3.14 x 4.41 x 100 x 0.50 = 173 μL => 0.17 mL

Avec un débit de 0.4 mL/min, 20 Volumes de colonnes représente 8.5 minutes

 

Conseils sur le bouchage, la contamination et le nettoyage des colonnes

Augmentation soudaine de la pression – toutes phases

Un pic de pression important, ou une forte augmentation perceptible de la pression de la colonne, est généralement le signe qu’une colonne est obstruée. Pour éliminer le colmatage, on peut essayer de retirer la colonne de l’instrument et de la faire fonctionner en sens inverse sans la connecter au détecteur pendant environ 20 volumes de colonne afin de déloger tout colmatage ou toute particule qui aurait pu s’accumuler sur le fritté de tête de colonne.
NB : il n’est pas recommandé de rincer à contre-courant les colonnes capillaires ou les colonnes HALO^® remplies de particules de 2 μm.

 

Nettoyage et régénération de la colonne

L’absorption d’impuretés accumulées peut être préjudiciable à la colonne, mais dans certains cas, ces impuretés peuvent être éliminées.
Les éléments ci-dessous expliquent comment cela peut être réalisé :

Nettoyage de la colonne pour toutes les colonnes non capillaires et de taille de particules > 2 μm.
Phases stationnaires C18, AQ-C18, C8, C4, C30, ES-CN, Phényl-Hexyl, PFP, RP-Amide, Biphényle et Diphényle.

Pour éliminer de la colonne les composés fortement retenus, rincer la colonne dans le sens inverse de son utilisation avec des solvants organiques purs dont les forces éluantes sont très élevées. (Ex : Acetonitrile, Methanol pour les solvants les plus utilisés). Si la force éluante n’est pas suffisante au nettoyage de la colonne, alors un mélange de dichlorométhane et de méthanol (95/5 v/v) est recommandé. Les cas extrêmes peuvent nécessiter l’utilisation de solvants très forts tels que le DMF ou le DMSO.
Dans tous les cas, les solvants utilisés doivent être parfaitement miscibles entre eux. La colonne doit préalablement être lavée des additifs salins contenus dans la phase mobile.
NB : il n’est pas recommandé de rincer à contre-courant les colonnes capillaires ou les colonnes HALO^® remplies de particules de 2 μm.

Régénération des colonnes toutes tailles de particules
Phases stationnaires C18, AQ-C18, C8, C4, C30, ES-CN, Phényl-Hexyl, PFP, RP-Amide, Biphényle et Diphényle.

Si la procédure précédente est inefficace, une autre méthode peut être tentée pour régénérer la colonne. Vous trouverez ci-dessous une procédure théorique qui s’est avérée efficace pour régénérer les colonnes en phase inverse (RP). En général, les procédures de régénération sont similaires, les solvants de lavage utilisés ont un pouvoir élutif supérieur, ce qui explique que des solvants apolaires soient utilisés. Il est essentiel que tous les solvants utilisés soient miscibles en série.

Les étapes 1 à 4 sont généralement suffisantes pour nettoyer en profondeur la plupart des colonnes, mais si cela s’avère insuffisant, les étapes 5 et 6 peuvent être ajoutées. Cependant, il est essentiel de laver avec de l’IPA après avoir utilisé un solvant fort apolaire tel que l’hexane avant d’introduire le système de solvant de rééquilibrage car l’eau ne se mélange pas avec l’hexane.

1) Méthanol
2) Acétonitrile
3) 50/50 ACN/IPA
4) IPA
5) Dichlorométhane
6) Hexane
7) IPA
8) Rééquilibrer aux conditions de départ.

 

Phase stationnaire hilic et penta-hilic.

Nettoyage de la colonne Phase stationnaire HILIC

Pour éliminer les composés fortement retenus sur la colonne, rincer la dans le sens inverse de son utilisation avec des mélanges de solvants organiques tels que le méthanol/Eau (50/50). Dans des cas extrêmes, il peut être nécessaire d’utiliser des solvants très puissants comme 100% d’eau. Alternativement, un mélange (95/5 v/v) de dichlorométhane et de méthanol est souvent efficace pour cette tâche. Pour réhydrater une colonne HILIC après l’avoir nettoyée, il peut être nécessaire de la conditionner d’abord en faisant passer une phase mobile de 70/30 ACN/H2O à un débit lent à travers la colonne pendant 2 à 3 heures.
NB : il n’est pas recommandé de rincer à contre-courant les colonnes capillaires ou les colonnes HALO^® remplies de particules de 2 μm.

 

Nettoyage de la colonne Penta-HILIC phase stationnaire

Pour éliminer de la colonne les composés fortement retenus, rincer la colonne dans le sens inverse avec des solvants très forts tels que le méthanol/Eau (10/90). Les cas extrêmes peuvent nécessiter l’utilisation de solvants très puissants comme 100% d’eau.

 

Stockage des colonnes (toutes les phases)

Stockage à long terme

Le stockage à long terme (plus de 5 jours) de la plupart des colonnes en phase inverse à base de silice est optimal dans de l’acétonitrile à 100%. L’exception à cette règle est la phase biphényle, qui doit être conservée dans du méthanol à 100%. Après l’analyse, rincez les tampons ou les sels utilisés pendant l’analyse avec la phase mobile sans tampons ou sels, puis rincez avec au moins 10 volumes de colonne d’acétonitrile pour le stockage.

 

Stockage à court terme

Le stockage à court terme (moins de 5 jours) des colonnes en phase inverse à base de silice peut se faire en toute sécurité dans la plupart des phases mobiles courantes. Cependant, il est recommandé, après analyse, de rincer les tampons ou les sels utilisés pendant l’analyse avec la phase mobile sans tampons ou sels, avant de stocker la colonne.

Quelles sont les procédures recommandées pour le nettoyage des colonnes HALO^® Protein ?

Si des composés hydrophobes sont adsorbés sur la colonne, un nettoyage par une série de gradients abrupts (1-5 minutes) peuvent être pratiqué :
*100% d’eau avec 0,1% de TFA à 100% d’ACN avec 0,1% de TFA
*Mélange isopropanol/eau avec 0,1% de TFA 80:20
*100% d’isopropanol avec 0,1% de TFA.

La température de la colonne doit être réglée à 50 °C et de grandes injections (100 μL pour une colonne de 4,6 mm soit 4% du volume de colonne) de 2,2,2-trifluoroéthanol peuvent être couplées à cette procédure tout en exécutant des gradients.

Une autre option, consiste à rincer la colonne avec de l’isopropanol acidifié pendant 20 à 50 volumes de colonne à une température de 50 °C.

Si l’on soupçonne la formation d’agrégats de protéines sur la colonne, la procédure ci-dessous est recommandée :
a. Rincer le canal à utiliser avec de l’eau à 100% sans la colonne.
b. Rincer la colonne (installée) avec de l’eau à 100% (10-20 volumes de colonne) pour éliminer tout solvant organique.
c. Préparer 6 M d’urée + 1 % (v/v) d’acide acétique dans un volume suffisant pour pomper le mélange à travers la colonne pendant 2 à 3 heures au débit normal de la colonne.
d. Rincer soigneusement la colonne et le canal avec de l’eau à 100 % pour s’assurer que tout le sel est éliminé.
e. Rincer la colonne avec du 20:80 organique/eau, puis avec du 100% organique.

Après avoir utilisé l’une de ces procédures, il est recommandé de procéder à plusieurs injections importantes de la ou des protéines cibles ou de BSA avant d’utiliser à nouveau en routine la colonne HALO^® Protein.